吸光度还是荧光?

DNA定量的最常用方法是紫外分光光度法和DNA结合染料的荧光测量。 第一种方法需要一个适合吸收测量的测量系统,后一个方法需要可以用于荧光测量的设备。 这是在选择要使用的DNA定量方法的仪器之前需要做的决定。 了解有关DNA定量方法的更多信息。

吸光度的读者

通过吸光度定量DNA浓度的两个最重要的选择是超微量分光光度计吸光度微孔板读数仪

超微量分光光度计

过去,比色皿分光光度计是通过吸光度定量DNA浓度的唯一可用选项。由于所需的大样本量和分子生物学中可用的小样本量,因此该应用受到很大限制。比色皿分光光度计的灵敏度比微量分光光度计要好,但所需的样品量非常大:半微量比色皿为300-400 µL,超微比色皿为70 µL。只有通过引入超微量分光光度计才能实现该方法应用的真正突破,该分光光度计可以测量通常为1 µL的微小液滴。用于DNA定量的比色皿分光光度计已基本被放弃,超微量体积分光光度计是用于单样品吸收测量的首选仪器。

用超微量分光光度计对DNA进行定量分析既简单又直接,但是必须单独测量样品,并且样品之间的清洁步骤很短。当需要对大量样品进行定量时,可以使用微孔板读数仪在更短的时间内测量更多样品。

微孔板光吸收读数仪

微孔板读数仪可以在短时间内测量许多样品,典型的板式为96孔和384孔,有些读数仪还可以读取1536孔或更多孔的板。与超微量分光光度计相比,微孔板读数仪的确在计算DNA浓度方面存在一些局限性:

  • 微孔板读数仪需要较大的样品量进行测量,但这可能取决于孔板的类型和制造商。孔密度越高,最小工作量越小,并且有小体积版本的常见微孔板可供选择。与超微量分光光度计中的测量相比,微孔板中的测量仍需要几倍的样品体积。在本文末尾的表格中,您将找到常见微孔板类型的最小工作量
  • 无法使用标准的聚苯乙烯微孔板,因为它们会阻挡紫外线,大多数主要制造商目前都可提供不阻挡紫外线的特殊微孔板。尽管它们比聚苯乙烯微孔板更昂贵,但它们比石英或石英底微孔板更实惠,更方便。
  • 当计算DNA浓度时(见DNA定量方法),光程是一个重要因素,并且取决于孔的几何形状和样品量。计算DNA浓度的公式需要1 cm的光程,并且在微孔板测量中必须使用光程校正。通过测量900和975 nm处样品的吸光度,可以很容易地计算出光程校正。

用于DNA定量的微容量微孔板

解决所有这三个问题的方法是使用微孔板进行DNA定量。 这种类型的微孔板使用的样品量很小(通常为2 µL),对紫外线是透明的,并且具有固定的光程长度,可以很容易地将其应用于计算中,而无需进行额外的测量。 尽管它们没有标准微孔板那么多的样品位置(通常是16个,而不是96个),但它们在样品量和通量之间提供了很好的折衷方案。 为了在微孔板读数仪中方便地定量DNA,我们提供了µDrop板,包括参数文件,可使用MikroWin软件轻松进行测量和计算。

就微孔板读数仪的选择而言,唯一的要求是能够测量低至230 nm的紫外线(因为该波长用于评估DNA的纯度)。 基于滤光片的读数仪和基于光栅的读数仪均适用于此应用程序。