BRET原理
BRET基于源自荧光素酶反应的能量，如果荧光蛋白靠近荧光素酶，则可用于激发荧光蛋白。该技术涉及将供体（萤光素酶）和受体（荧光）分子融合到目标蛋白质上。融合构建体在活细胞中的共表达使它们的相互作用得以实时定量研究。当接近时（通常在10 nm以内），能量通过非辐射偶极-偶极耦合从供体传递到受体，从而导致特定波长的荧光发射。受体发射的能量相对于供体发射的能量称为BRET信号。它取决于供体和受体分子的光谱性质，比率，距离和相对方向，以及目标蛋白质之间相互作用的强度和稳定性。
BRET与FRET非常相似，但在FRET中，供体是一种可以被激发的荧光蛋白。由于BRET不需要外部光源来激发供体，因此其背景非常低，并且不会遇到与FRET经常相关的问题，例如自发荧光，光散射或光漂白。 BRET的其他优点是，它是一种非放射性且均质的技术，并且比率度量信号最大程度地减少了来自分析条件的干扰。
BRET方法
在过去的几年中，已经开发了不同的BRET方法，所有方法都有其局限性和优势。 下表列出了各种供体和受体对及其相应的波长：
方法 | 供体 | 底物 | 供体发射波长[nm] | 受体 | 受体发射波长(nm) |
|---|---|---|---|---|---|
| BRET 1 | RLuc | Coelenterazine | 480 | eYFP | 530 |
| BRET 2 | RLuc | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | 绿色荧光蛋白 | 510 |
| eBRET 2 | RLuc8 | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | 绿色荧光蛋白 | 510 |
| BRET 3 | 萤火虫 | 荧光素 | 565 | DsRed | 583 |
| QD-BRET | RLuc/RLuc8 | Coelenterazine | 480 | QDot | 605 |
| NanoBRET | NanoLuc® | Furimazine | 460 | HaloTag®配体 | 618 |
BRET 1
最初使用腔肠素作为底物的原始BRET方法被称为BRET 1，其特点是信号强，寿命长。
BRET 2
与BRET 1相比，BRET2在供体和受体发射峰之间有更好的分离。 这使得BRET 2成为需要高信噪比的分析的更好选择。 BRET 2的明显局限性是低发光和短寿命。
Enhanced BRET 2 (eBRET)
与最初的BRET 2版本相比，eBRET的信号强度最高可以提高5倍。 eBRET使用一种称为Rluc8的新海肾荧光素酶突变体。。
BRET 3
BRET 3中的萤火虫荧光素酶在发射波长（565 nm）处显示较低的细胞自发荧光，但缺点是信号微弱，且供体和受体发射峰重叠。
QD-BRET
全新的BRET版本是量子点-BRET（QD-BRET）。 发射峰清楚地分开，这使得QD-BRET非常适合筛选应用。 缺点是QD分子较大（1.5-6 nm），无法对QD蛋白进行遗传编码。 QD蛋白无法在活细胞中表达，必须添加。
NanoBRET™
NanoBRET™使用的萤光素酶比传统的萤光素酶NanoLuc®亮得多。 供体发射（460 nm）和受体发射（618 nm）之间有很好的分离。
BRET应用
BRET可以在微孔板读数仪中测量，以研究蛋白质-蛋白质相互作用，尤其是在G-蛋白质偶联受体研究领域。研究活的哺乳动物细胞中相互作用的能力规避了许多与技术相关的问题，例如共免疫沉淀和酵母双杂交筛选。 BRET的高灵敏度使得能够在生理浓度下研究蛋白质，这比需要高水平蛋白质表达的技术具有显着优势。
特别是在G蛋白偶联受体研究领域，BRET技术提供了建立均质，通用和功能性分析的机会。利用这样的事实，即β-arrestin在受体的脱敏中自然起作用；与活化受体的细胞内部分结合。 G蛋白偶联受体也称为7跨膜（7TM）受体，包含已知最大，最多样化的蛋白质超家族。
要了解GPCR在药物开发中的重要性，请执行以下操作：
- 目前，约有30％的药物针对GPCRs靶点
- 仅有5％的已知受体被药物靶向
- 剩下的只有20％的相应配体是已知的
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