FRET原理

FRET基于这样一个事实，供体染料（例如CFP）处于激发态可以通过非辐射偶极-偶极偶合转移一部分能量到类似YFP的受体分子上。 该技术涉及将供体和受体荧光蛋白融合到目标分子上。 融合构建体在活细胞中的共表达使它们的相互作用得以实时定量研究。  当两种蛋白质发生相互作用时，两种染料相互靠近就可以检测到来自受体的发射。 

FRET的应用

FRET用于许多大分子的结构发生变化或配体与大分子结合的分析中，尤其是在蛋白质与蛋白质相互作用的研究中。

FRET to Study GPCR Oligomerization with Mithras FRET as a Tool to Study G-protein Coupled Receptor Oligomerization in HEK Cells.

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FRET的替代品

FRET的局限性是需要外部激发来启动荧光转移，这可能导致结果中出现背景噪声。 这是由于受体的直接激发或由于光漂白引起的。 为了避免此缺点，已经开发了几种替代方法：

  • 生物发光共振能量转移（BRET）使用生物发光荧光素酶作为供体，导致背景非常低。
  • 时间分辨FRET（TR-FRET）使用不同的方法来避免干扰：它使用荧光寿命很长的荧光团，以避免荧光寿命短的分子或其他因素（最重要的是激发光）引起的干扰。 选择的荧光团通常是镧系元素的螯合物（最常见的是Eu，Ter和Sa）。 这结果导致了高稳定性和灵敏度的分析。

推荐用于FRET的仪器

能够使用滤光片测量荧光的高灵敏度微孔板读数仪是FRET的最佳组合。 可以使用带有光栅的读数仪，但性能较低。 必须在不同的波长下执行2次测量，并且需要至少具有2个发射滤光片的仪器（使用一个带1个激发滤光片+ 1个发射滤光片的单个滤光片的仪器无法测定）。 推荐将以下微孔板读数仪用于FRET。